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La lesione del midollo spinale (SCI) rappresenta una sfida clinica complessa della medicina contemporanea con un impatto profondo sulla qualità della vita dei pazienti a causa di un limitato recupero funzionale. Il fallimento rigenerativo del sistema nervoso centrale (SNC), nettamente inferiore rispetto al periferico (SNP)(Huebner and Strittmatter, 2009), è determinato dalla ridotta capacità intrinseca dei neuroni maturi (Fawcett, 2020)e da un microambiente esterno ostile (Filous and Schwab, 2018; Quraishe et al., 2018). Il presente progetto propone una strategia innovativa per superare una di queste barriere mediante il metodo del “Cleave&Elongate", che integra nanomedicina, biologia molecolare e neuroscienze. Nello specifico, il metodo proposto prevede l’utilizzo di un nanocomplesso costituito da nanoparticelle d’oro (GNP) e dalla proteina Cas13d la quale con RNA guida (gRNA) appropriata, scinde un mRNA specifico, riducendo così potenzialmente l’espressione di una determinata proteina. L'obiettivo del progetto è contrastare la cascata di segnalazione inibitoria dei proteoglicani solfati di condroitina (CSPGs) quando legano il recettore di membrana Receptor-typetyrosine-proteinphosphatase (PTPσ) (Shen et al., 2009; Sharma et al., 2012).

Per riprodurre l’ambiente inibitorio tipico delle lesioni del sistema nervoso centrale, neuroni ippocampali primari sono stati trattati con tre concentrazioni di CSPG (0,5, 1 e 1,5 μg/mL) al fine di individuare la condizione più adatta a inibire la crescita neuritica senza indurre eccessiva citotossicità, seguendo un protocollo pubblicato precedentemente dal gruppo di ricerca (Capitanini et al., 2025). Come atteso, il trattamento con CSPG ha determinato una riduzione dose-dipendente della lunghezza assonale. Per gli esperimenti successivi è stata quindi selezionata la concentrazione intermedia di 1 μg/mL.
In parallelo, è stata identificata tramite NCBI la sequenza del trascritto murino di PTPσ e ne sono state analizzate le regioni accessibili al legame con Cas13d.Sfruttando alcuni strumenti online è stato dunque possibile progettare le guide necessarie per la corretta azione della proteina Cas13d. Inoltre, la proteina in questione è stata prodotta, purificata e quantificata mediante metodi standard all’interno del nostro laboratorio.
È stata poi valutata la citotossicità delle GNP non funzionalizzatesu neuroni ippocampali per determinare la concentrazione ottimale per i successivi esperimenti. Per far questo, i neuronisono stati trattati 4 ore dopo la semina con diluizioni scalari di GNP (da 10¹³ GNP/mLa 10⁵ GNP/mL). La vitalità cellulare è stata poi analizzatamediante microscopia.Il saggio ha mostrato che le GNP non funzionalizzatepresentano, in generale, bassa tossicità, ad eccezione della concentrazione più elevata. Tuttavia, prevedendo una riduzione della concentrazione di particelle nelle successive fasi di funzionalizzazione, è stato ritenuto opportuno utilizzare la soluzione stock (10¹³ GNP/mL) come punto di partenza per i successivi test di tossicità sulle GNP funzionalizzate.
Un secondo test di tossicità è stato effettuato sulle GNP funzionalizzate con la proteina Cas13d, mediante un approccio simile a quello descritto. I risultati ottenuti non hanno mostrato una differente tossicità tra le GNP funzionalizzate e le GNP non funzionalizzate alla stessa concentrazione. Tuttavia, rispetto al precedente esperimento (tossicità delle GNP non funzionalizzate) abbiamo riscontrato un aumento generale della morte cellulare a quella concentrazione di GNP (sia nella forma nuda che in quella funzionalizzata) rispetto al gruppo non trattato (controllo), evidenziando una possibile variabilità che dovremo approfondire con esperimenti futuri.
La cinetica di ingresso delle Cas13d-GNPs nei neuroni ippocampali è stata analizzata tramite microscopia confocale in tempo reale tracciando la proteina con un gRNA fluorescente untargeted. L'acquisizione dinamica ha mostrato che l'internalizzazione cellulare inizia già 4 ore dopo la somministrazione, con un picco intorno alle 14 ore. Questo risultato è fondamentale in quanto permette di dimostrare l’ingresso della proteina Cas13d all’interno del citoplasma, dove potenzialmente avviene la sua azione.
A questo punto, abbiamo effettuato un test preliminare nel nostro sistema: abbiamo valutato la possibilità di promuovere un recupero del fenotipo (lunghezza assonale) in neuroni ippocampali di topo cresciuti su una matrice di CSPG (1 μg/mL) mediante somministrazione diGNP-Cas13d diretta verso il target specifico:PTPσ. Questo esperimento pilota ha evidenziato un recupero del 16% delle lunghezze assonali nel gruppo trattato (CSPG+GNP-Cas13d) rispetto al non trattato (CSPG), mostrando un promettente effetto di recupero. Tale esperimento andrà tuttavia ripetuto e verificato.

Conclusioni

I dati preliminari ottenuti, sebbene richiedano ulteriori approfondimenti, sono molto promettentie suggerisconouna prospettiva positiva per il successo del trattamentocon Cas13d-GNPin vitro.Nel corso dello studio sono state completate con successo le fasi di espressione e purificazione di Cas13d e il design di due gRNA specifiche per il recettore PTPσ. Successivamente è stata valutata la tossicità delle GNP non funzionalizzate, per stabilire la concentrazione ottimale per la successiva funzionalizzazione, e la tossicità dei nanocomplessi Cas13d-GNP.Abbiamo poi verificato l'internalizzazione cellulare di Cas13d-GNP,confermata con successo indirettamente tramite una gRNA fluorescente untargeted.Infine, la nanoformulazione è stata testata su un modello in vitro di inibizione della rigenerazione basato su neuroni ippocampali coltivati su CSPG(1 μg/mL). In questo esperimento pilota il trattamento con Cas13d-GNP ha indotto un promettente recupero del 16% della lunghezza assonale rispetto ai controlli non trattatisu CSPG. Sebbene preliminari, questi risultati forniscono la prima evidenza che l'approccio Cleave&Elongate, mediante il taglio dell'mRNA di PTPσ da parte di Cas13d tramite somministrazione di GNP, può migliorare il fenotipo dei neuroni primari del SNC in condizioni inibitorie. I futuri esperimenti si concentreranno sulla riproduzione dell'esperimento pilota e sulla valutazione di marker morfologici e fisiologici, in modo da rendere i risultati ottenuti più robusti.

Coordinatori di progetto:
Dr. Alessandro Falconieri, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa
Prof. Vittoria Raffa, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa

Collaboratori
Dr. Elena Landi, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa
Dr. Alessandro De Carli, Dipartimento di Medicina Traslazionale, Università di Pisa
Dr. Michele Lai, Dipartimento di Medicina Traslazionale, Università di Pisa
Dr. Soultana Konstantinidou, Dipartimento di Biologia, Università di Pisa

Studenti
Maria Luisa Lucignano, Marco Mori

 

Referenze
Capitanini, E., Talarico, L., De Vincentiis, S., Giacomelli, C., Vitolo, S., Da Palmata, L., et al. (2025). Force inducesaxongrowth in inhibitoryconditions. EngineeredRegeneration 6, 133–145.
Fawcett, J. W. (2020). The struggle to make CNS axonsregenerate: whyhasitbeen so difficult? Neurochem. Res. 45, 144–158.
Filous, A. R., and Schwab, J. M. (2018). Determinants of axongrowth, plasticity, and regeneration in the context of spinal cord injury. Am. J. Pathol. 188, 53–62.
Huebner, E. A., and Strittmatter, S. M. (2009). Axon regeneration in the peripheral and centralnervous systems. Cell biology of the axon, 305–360.
Quraishe, S., Forbes, L. H., and Andrews, M. R. (2018). The extracellularenvironment of the CNS: influence on plasticity, sprouting, and axonalregeneration after spinal cord injury. Neural Plast. 2018, 2952386Report sul Progetto: “Nuove frontiere nella terapia del sistema nervoso centrale: inibizione localizzata dei recettori PTPσ/LAR tramite nanoformulazioni d’oro di CRISPR-Cas13d”